Johannes Brenz wurde am 26. Juni 1499 als Sohn des Goldschmieds Martin Heß, genannt Brenz, und der Katharina Hennig in der Reichsstadt Weil geboren, wo der Vater längere Zeit das Ehrenamt eines Schultheißen bekleidete. Brenz studierte seit 1514 in Heidelberg und nahm dort 1518 an der Disputation Martin Luthers teil, einem wissenschaftlichen Streitgespräch, in dem Luther die Grundlagen einer neuen Theologie vorstellte. Für die lutherische Lehre gewonnen, wurde Brenz 1522 als Prediger nach Schwäbisch Hall berufen, wo er begann, im Sinne der Reformation zu wirken. 1528 nahm er an der Marburger Disputation zwischen Luther und dem Züricher Reformator Huldrich Zwingli teil, in deren Mittelpunkt die Abendmahlsfrage stand. Brenz wurde alsbald zum gefragten theologischen und juristischen Ratgeber für Reformationen in weiteren Territorien, so auch seit 1534 in Württemberg.
Nach dem Schmalkaldischen Krieg 1546/47 hatte Kaiser Karl V. auf dem Augsburger Reichstag 1548 das sogenannte Interim erlassen, eine Übergangsregelung für die protestantischen Territorien, die diese wieder an den altgläubigen Ritus annähern sollte. Weil Brenz sich in Wort und Schrift gegen das kaiserliche Interim wandte, wurde vom Haller Rat seine Auslieferung verlangt, weshalb er am 24. Juni 1548 Schwäbisch Hall verlassen musste. Er begab sich zunächst nach Württemberg, wo er aufgrund seiner früheren Tätigkeit im Land hoffen konnte, dass man ihm Unterschlupf gewähren würde. Die folgenden Jahre versteckte er sich unter dem Schutz des Herzogs von Württemberg.
An diese Zeit knüpft sich die legendarische Erzählung, wonach sich Brenz einmal auf dem Dachboden eines Hauses in Stuttgart hinter einem Stapel Brennholz verbergen musste, weil spanische Soldaten (also die Truppen des Kaisers) jedes Haus in der Stadt nach ihm durchsuchten. Dies ging mehrere Tage, während derer er von einer Henne versorgt wurde, die jeden Tag ihr Ei bei seinem Versteck legte. Es handelt sich hier um eine Nachbildung der alttestamentlichen Geschichte von den wilden Raben, die den Propheten Elia beim Bach Krith versorgten (1. Könige 17). Die Geschichte gehört zum Stuttgarter Sagenschatz des 19. Jahrhunderts, wobei man sogar die Adresse des Hauses anzugeben wusste.
Nach dem Tod Herzog Ulrichs am 6. November 1550 übernahm sein Sohn, Herzog Christoph, die Regierung und zog für kirchliche Angelegenheiten auch Brenz zurate. Er beauftragte ihn mit der Abfassung eines Bekenntnisses (Confessio Virtembergica) zur Vorlage bei dem in Trient tagenden Konzil, das dort am 24. Januar 1552 auch übergeben wurde. Unter seiner Leitung reiste im Frühjahr 1552 eine theologische Gesandtschaft nach Trient, um etwaige Rückfragen zu beantworten. Wegen des Fürstenaufstands des Kurfürsten Moritz von Sachsen löste sich jedoch das Konzil vorzeitig auf, weshalb sich die württembergische Gesandtschaft unverrichteter Dinge auf den Heimweg machen musste.
Der Passauer Vertrag mit König Ferdinand vom 2. August 1552 gestattete die evangelische Religionsausübung im Reich. Damit konnte die Neuordnung der Kirche in Württemberg angegangen werden. Zum 10. Januar 1553 wurde Brenz zum Propst der Stuttgarter Stiftskirche ernannt. Der Titel, der der vorreformatorischen Stiftsverfassung entstammt, bezeichnete Brenz als den obersten Geistlichen der evangelischen Kirche des Landes. Seine Dienstwohnung war die Propstei, die sich gegenüber dem Haupteingang der Stiftskirche befand (heute Stiftsstraße 5). Ein Amtszimmer wurde ihm in der Kanzlei angewiesen, die mit dem Schloss durch eine Brücke verbunden war. So war die unmittelbare Verbindung mit dem Herzog, zu dem Brenz jederzeit Zutritt hatte, wesentlich erleichtert.
In seiner Stellung als Stiftspropst hatte Brenz einen wesentlichen Anteil am organisatorischen Neuaufbau der württembergischen Kirche. Es wurde das Amt des Spezialsuperintendenten geschaffen und eine Einteilung des Landes in vier Sprengel vorgenommen, wobei in jedem ein Generalsuperintendent als Vorgesetzter der Spezialsuperintendenten wirkte. Der Kirchenrat, später als Konsistorium bezeichnet, bildete eine der drei Regierungsbehörden, neben Rentkammer und Oberrat. Damit war ein klarer hierarchischer Aufbau der Kirche erfolgt. Die Kirchenorganisation wurde durch die 1559 erschienene Große Kirchenordnung Brenz‘ abgeschlossen, die nicht nur die kirchlichen Angelegenheiten im engeren Sinne, sondern auch das Eherecht, das Schulwesen und die Armenpflege regelte. Diese Ordnung der württembergischen Kirche wurde Vorbild für eine Anzahl weiterer Territorien des Reichs. Das Herzogtum gewann damit eine Bedeutung für das evangelische Deutschland, die seine tatsächliche Größe überstieg.
Unmittelbar auf Brenz geht außerdem die Umbildung von 13 Männerklöstern in Schulen im Jahr 1556 zurück. Diese Klosterschulen dienten der Vorbereitung auf das theologische Studium. Die Klosteräbte wurden durch evangelische Theologen ersetzt, die als Prälaten Mitglieder des Landtags waren. Als der Landtag 1565 auf Initiative der Prälaten vom Herzog die Festschreibung der Ergebnisse der Reformation verlangte, konnte sich Herzog Christoph erst durch die Vermittlung von Brenz damit einverstanden erklären.
Als Propst der Stiftskirche war Brenz zugleich Pfarrer von Stuttgart, wurde aber in seinen Dienstobliegenheiten durch zwei weitere Geistliche (Diakone) unterstützt. Brenz hat, wenn er nicht durch Dienstreisen abgehalten war, nicht nur die Predigt an Sonn- und Feiertagen, sondern auch die Wochenpredigten übernommen, in denen die fortlaufende Auslegung eines biblischen Buches üblich war. 1568 wurde er altershalber von seinen Predigtverpflichtungen befreit. Seine Bibelauslegung, die zu einem großen Teil in sieben der acht Foliobände umfassenden, 1576 bis 1590 erschienenen Ausgabe seiner Werke enthalten ist und fast alle Bücher der Bibel behandelt, entstand aus seiner Predigttätigkeit.
Johannes Brenz starb nach kurzer Krankheit am 11. September 1570 in Stuttgart und wurde am Tag darauf in der Stuttgarter Stiftskirche begraben, wo sein Epitaph an einem Pfeiler der nördlichen Wand des Schiffs in der Nähe der Kanzel an ihn erinnert. Von dem ursprünglichen Epitaph, das im Zweiten Weltkrieg zerstört wurde, konnte das Porträt von Brenz gerettet werden, das in eine Nachbildung eingefügt wurde.
Das Epitaph bezeichnet nicht die ursprüngliche Stätte des Grabes, vielmehr wurde er unter der Kanzel beerdigt. Hieran knüpft sich die schon im 16. Jahrhundert berichtete, auf Jakob Andreae zurückgehende Geschichte, dass Brenz sich diesen Platz zum Grab erwählt habe, damit er, falls jemand von der Kanzel eine andere Lehre als er verkünden würde, sein Haupt aus dem Grab erheben und rufen könne: „Du lügst!“
Bei Grabungen zur Erneuerung der Heizungsanlage im Jahre 1908 wurden die Überreste des Leichnams gefunden und wieder vor dem Aufgang bei der Kanzel beigesetzt. Dieser Sarg wurde bei der Wiederherstellung der Stiftskirche 1955 fast unbeschädigt geborgen, in der Nähe der Kanzel aufs Neue versenkt und die Stelle mit einer Inschrift markiert. Bei der letzten Renovierung der Stiftskirche 1999 bis 2003 fand sich der Sarg in beschädigtem Zustand wieder. Die Gebeine wurden nach einer paläoanthropologischen Untersuchung in einem neuen Sarg abermals beigesetzt. Die Stelle ist sowohl bei der Kanzel wie auch in der neu entstandenen Unterkirche durch Inschriften bezeichnet.