Karl Eugen von Württemberg wurde am 11. Februar 1728 als ältester Sohn von Karl Alexander von Württemberg und dessen Gemahlin Maria Augusta von Thurn und Taxis in Brüssel geboren. Nachdem Herzog Eberhard Ludwig von Württemberg ohne männlichen Erben verstorben war, rückte Karl Eugen 1733 mit der Thronbesteigung seines Vaters unerwartet in die Position des Erbprinzen. Er verbrachte seine ersten Lebensjahre in Brüssel und übersiedelte erst 1736 zusammen mit seinen beiden jüngeren Brüdern Ludwig Eugen und Friedrich Eugen nach Stuttgart. 1737, nach dem Tod seines Vaters, wurde der noch minderjährige Erbprinz zunächst durch eine vormundschaftliche Regierung vertreten. Auf Initiative Friedrichs des Großen von Preußen war Karl Eugen von 1741 bis 1744 zur Ausbildung am Berliner Hof. Dem Aufenthalt in Preußen verdankte er entscheidende Impulse, die sein kulturelles und städtebauliches Interesse nachhaltig prägten.
Im Alter von 16 Jahren trat der von Kaiser Karl VII. für mündig erklärte Karl Eugen schließlich 1744 die Herrschaft an. In seinen frühen Regierungsjahren zeigte er wenig Interesse an Politik. Hingegen waren seine Ambitionen auf dem Gebiet der höfischen Repräsentation stark ausgeprägt. Da das Alte Schloss seinen Vorstellungen einer zeitgemäßen Residenz nicht entsprach, plante er den Bau eines neuen Residenzschlosses. Sowohl die Stadt Stuttgart als auch die württembergische Ständevertretung fürchteten eine Verlegung des Hofes nach Ludwigsburg, weshalb sie das Vorhaben mit beträchtlichen Geldzuschüssen unterstützten. Bereits unmittelbar nach seinem Regierungsantritt begann der junge Herzog mit der Projektierung des Bauvorhabens, mit dem er den italienischen Baumeister Leopoldo Retti beauftragte. Am 3. September 1746 legte Karl Eugen den Grundstein zum Bau des Neuen Schlosses. Nach Rettis Tod setzte der aus Paris angeworbene Architekt Philippe de La Guêpière ab 1752 den Bau fort. Die Errichtung des Neuen Schlosses war das bedeutendste städtebauliche Projekt Karl Eugens in Stuttgart. Die Bauzeit erstreckte sich mit Unterbrechungen über seine gesamte Regierungszeit.
Im Jahr 1748 heiratete Karl Eugen Prinzessin Elisabeth Friederike Sophie von Brandenburg-Bayreuth, eine Nichte König Friedrichs des Großen. Zum Einzug des herrschaftlichen Paares wurden in Stuttgart fünf Tage lang Feierlichkeiten veranstaltet und verschiedene Gebäude instand gesetzt. Auch zwei Stadttore, das Esslinger Tor und das Büchsentor, wurden zu diesem Anlass erneuert. Karl Eugen und Elisabeth Friederike verband in den ersten Ehejahren vor allem das gemeinsame Interesse für das Theater und die Oper. Obwohl es in den Jahrzehnten vor Karl Eugens Regierungsübernahme nicht einmal ein festes Theaterensemble in Stuttgart gegeben hatte, gelang es ihm innerhalb kürzester Zeit unter erheblichem finanziellem Aufwand, eine international beachtete Opernbühne zu etablieren. Er warb den neapolitanischen Komponisten Niccolò Jommelli als Hofkapellmeister sowie erstrangige Sänger, Musiker, Balletttänzer und Bühnenbildner an. Ab 1750 wurde im Saal des Neuen Lusthauses ein Theater eingebaut, dessen Pläne Philippe de La Guêpière als eines seiner architektonischen Hauptwerke 1772 im neunten Tafelband der Encyclopédie von Denis Diderot und Jean Baptist le Rond d’Alembert veröffentlichte. Die Beziehung zwischen Karl Eugen und seiner Frau verschlechterte sich durch Unstimmigkeiten sowie den frühen Tod des einzigen Kindes jedoch so sehr, dass sich Elisabeth Friederike 1756 von ihm trennte und an den Hof ihrer Eltern nach Bayreuth zurückkehrte. Die katholisch geschlossene Ehe bestand bis zum Tod der Herzogin 1780 formal weiter.
Der Ausbruch des Siebenjährigen Krieges lenkte Karl Eugens Interesse auf die Außenpolitik. Die württembergischen Truppen beteiligten sich – teilweise unter seiner persönlichen Führung – an mehreren Feldzügen auf Seiten des Reiches. Da dem Herzog als Feldherr kein Erfolg beschieden war, zog er sich 1761 aus dem Kriegsgeschehen zurück. Zeitgleich rückten innenpolitische Angelegenheiten sowie sein kulturelles Engagement wieder stärker in den Fokus. Im Juni 1761 gründete er die erste württembergische Kunstakademie (Académie des Arts). Bald danach erfolgte in Ludwigsburg die Gründung der ersten öffentlichen Bibliothek Württembergs (1765), die Vorgängerinstitution der heutigen Württembergischen Landesbibliothek.
Wegen seiner verschwenderischen Hofhaltung geriet Karl Eugen zunehmend in Konflikt mit der württembergischen Ständevertretung. Die geplante Einführung einer Vermögenssteuer 1763/64 führte zu einer juristischen Auseinandersetzung zwischen ihm und den Landständen vor dem Wiener Reichshofrat. Mit dem 1770 verabschiedeten „Erbvergleich“ wurde die württembergische Verfassung bestätigt, und Karl Eugen musste in der Folge seine finanziellen Ausgaben einschränken. Viele der beim Theater beschäftigen Künstler wurden entlassen. Aus Ärger über die Landstände verlegte Karl Eugen die Residenz 1764 nach Ludwigsburg. Für Stuttgart hatte dies nachteilige Folgen. Die Einwohnerzahl sank drastisch, da fast alle mit dem Hof verbundenen Verwaltungsbehörden und Institutionen wegzogen. Außerdem verlor die Stadt ihre Attraktivität als Wirtschaftsstandort und musste dadurch erhebliche Einbußen hinnehmen.
Ab den 1770er Jahren war Karl Eugens Regierungsstil stärker als in den frühen Jahren vom Gedankengut der Aufklärung und merkantilistischen Ansätzen geprägt. Er startete eine Bildungsinitiative, um die wissenschaftliche, technische und künstlerische Ausbildung seiner Landeskinder zu verbessern, versuchte die landwirtschaftlichen Erträge zu steigern, förderte den Wein- und Obstanbau und schuf Anreize für die Ansiedlung von Manufakturen und Fabriken. Die Stadt Stuttgart profitierte insbesondere von der von Karl Eugen gegründeten Hochschule, die nach mehreren Namenswechseln unter dem Namen Hohe Karlsschule bekannt wurde. Sie ging aus einer 1770 auf Schloss Solitude eingerichteten Schule für Gärtner und Stuckateure hervor.
Nachdem Karl Eugen im „Erbvergleich“ Stuttgart die Rechte einer Residenzstadt hatte zurückgeben müssen, zog die Einrichtung 1775 von der Solitude in die Stadt um. Die 1782 zur Universität erhobene Karlsschule verfügte über junge, hervorragende Lehrkräfte und erteilte Unterricht in den Fächern Philosophie, modernen Fremdsprachen (Französisch, Italienisch, Englisch), Medizin, bildende und darstellende Künste, Naturwissenschaften, Rechts-, Wirtschafts-, Staats- sowie Militärwissenschaften. Fast alle württembergischen Staatsmänner der ersten Hälfte des 19. Jahrhunderts waren Absolventen. Der Dichter Friedrich Schiller verdankte der Stuttgarter Militärakademie ebenso wie der französische Naturforscher Georges Cuvier eine umfassende Ausbildung. Mit ihrem fortschrittlichen Bildungskonzept stellte die Karlschule trotz der häufig kritisierten militärischen Disziplinierung der Schüler eine Konkurrenz für die in Traditionen verharrende Universität Tübingen dar. Trotz ihrer Schließung nach dem Tod Karl Eugens legte die Karlsschule mit ihrem an praktischen Problemstellungen orientierten Lehrplan, dessen moderne Ausrichtung später von der Stuttgarter Realschule und dem Polytechnikum fortgeführt wurde, eine wichtige Grundlage für den wirtschaftlichen Erfolg Württembergs als Industriestandort in der Gründerzeit. Karl Eugens direkte Maßnahmen zur Förderung der Wirtschaft und des Handels blieben hingegen wenig erfolgreich und betrafen eher Cannstatt, Ludwigsburg oder Calw als die Residenzstadt Stuttgart. In Cannstatt ließ Karl Eugen zum Beispiel den Neckarhafen ausbauen sowie einen Kran zum Be- und Entladen der Schiffe errichten.
Mit dem sogenannten Residenzbauplan gab Karl Eugen wichtige Weichenstellungen für die städtebauliche Weiterentwicklung Stuttgarts vor. Bereits in seinen ersten Regierungsjahren hatte er zahlreiche Verordnungen erlassen, um das Erscheinungsbild der Stadt aufzuwerten und die Infrastruktur zu modernisieren. Diese vereinzelten Maßnahmen, welche neben der Verschönerung die Verbesserung der Wohn- und Lebensqualität der Bürger zum Ziel hatten, wurden ab 1775 von Hofarchitekt Reinhard Ferdinand Fischer gebündelt und in ein städtebauliches Konzept eingebunden. Dieses umfasste die Anlage von Plätzen mit Grünanlagen und Baumbestand (Karlsplatz) sowie Prachtboulevards und Alleen als Promenaden (Planie). Offene Wasserläufe wie der Wassergraben am Alten Schloss und der Nesenbach wurden stellenweise kanalisiert und Gewerbetreibende, die Verschmutzungen und Geruchsbelästigung verursachten, wie beispielsweise die Gerber, aus dem Stadtgebiet ausgewiesen. Karl Eugen förderte außerdem gezielt den privaten Wohnungsbau, so dass ab 1775 500 neue Häuser in Stuttgart entstanden. Die Einwohnerzahl blieb zwischen 1758 (17.225 Einwohner) und 1798 (17.467 Einwohner) – abgesehen von dem Rückgang durch die Verlegung der Residenz – nahezu konstant. Fischer führte auch die Bauarbeiten am Neuen Schloss fort und baute die neben dem Schlossrohbau stehende Kaserne zur Militärakademie um. Beide Gebäude wurden im Zweiten Weltkrieg zerstört.
Obwohl Herzog Karl Eugen die urbanistische Neuordnung der Stadt Stuttgart ein wichtiges Anliegen war, hielt er sich nach dem „Erbvergleich“ nur noch bei offiziellen Anlässen in seiner Residenz auf. Ab 1770 lebte er gemeinsam mit seiner Mätresse Franziska von Hohenheim die meiste Zeit in seinen Landschlössern. Bereits 1764 hatte er mit dem Bau des in reizvoller Aussichtslage nordwestlich von Stuttgart gelegenen Jagd- und Lustschlosses Solitude begonnen, dessen architektonische Gestalt vermutlich auf seine eigenen Entwürfe zurückgeht. Das Waldgebiet um die Solitude mit seinen barocken Wegachsen ist bis heute ein beliebtes Naherholungsgebiet für die Stuttgarter Bürger. Ab 1776 wurde das von Franziska bevorzugte Landgut Hohenheim zum ständigen Aufenthaltsort des Paares. Die 1785 heimlich geschlossene Ehe Karl Eugens mit der nicht standesgemäßen, geschiedenen Protestantin wurde erst 1791 von Papst Pius VI. anerkannt. In Hohenheim verwirklichte Karl Eugen mit der Anlage eines englischen Landschaftsgartens („Dörfle“) und dem Neubau des Hohenheimer Schloss ab 1785 das letzte groß angelegte Bauprojekt seiner Regierungszeit, dessen Vollendung er jedoch nicht mehr erlebte. Er starb am 10. Oktober 1793 in Hohenheim.